Ausgangssituation
Die Denaturierung von Kollagen ist ein Prozess, der zwar stark untersucht und wirtschaftlich relevant, aber auf atomarer Ebene noch nicht vollständig verstanden ist. Dies gilt insbesondere für quervernetztes Kollagen. Kollagen ist nicht nur das häufigste Protein im tierischen Organismus, welches in Form von Fasern und Fasernetzwerken Muskeln, Sehnen, Bändern, Knochen, Knorpeln und Haut Gestalt, Stabilität und Elastizität verleiht, es ist auch wichtiges Biomaterial, wird in großen Mengen in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie, der Medizin und der kosmetischen Industrie eingesetzt und in Form von Leder im Millionen-Tonnen-Maßstab in der Bekleidungs-, Möbel- und Automobilbranche verwendet. Wie alle Proteine denaturiert Kollagen bei erhöhten Temperaturen irreversibel, was mit dem Verlust der ursprünglichen Struktur und der nativen Funktion einhergeht und bei Fixierung in einem Gewebe oder Materialverbund Schrumpfkräfte hervorrufen kann. Für manche Produkte ist die Denaturierung dabei erwünscht, für andere führt sie zum völligen Funktionsverlust und kann darüber hinaus zerstörerische Effekte auf den gesamten Materialverbund haben. Das Denaturierungsverhalten ist dabei stark abhängig von verschiedenen Einflüssen (Aminosäuresequenz, Lösungsmittel und Wassergehalt, Fremdstoffe, Art und Anzahl der Quervernetzungen, Temperatur und Temperaturänderungsrate, Konzentration, Fixierung usw.). Eine Vorhersage des Denaturierungsverhaltens in Abhängigkeit dieser Einflussfaktoren ist deshalb von hoher wissenschaftlicher und wirtschaftlicher Bedeutung.
Projektziel
Ziel des Forschungsvorhabens war es, für die Aufklärung des Denaturierungsmechanismus von quervernetztem Kollagen ein Werkzeug zu entwickeln, welches auf Basis von Molekulardynamik (MD)-Simulationen ermöglicht, die Auswirkungen verschiedener Einflussfaktoren (wie Aminosäuresequenz, Wassergehalt, Art und Menge der Quervernetzung) auf den Denaturierungsprozess abzuschätzen. Damit sollte der Denaturierungsprozess auf atomarer Ebene beschreibbar und vorhersagbar werden.
Lösungsweg
Um dieses Ziel zu erreichen, wurden zunächst experimentelle Untersuchungen an kleinen, experimentell und simulativ gut handhabbaren Modellpeptiden (collagen like peptides, CLPs) mit definierter Aminosäuresequenz und einer Länge von ca. 30 Aminosäuren pro Kette durchgeführt. Damit wurden experimentelle Vergleichsdaten für die Entwicklung und Validierung des Simulationswerkzeuges generiert. Es wurden Denaturierungstemperatur und -enthalpie mittels Dynamischer Differenzkalorimetrie in Abhängigkeit verschiedener Einflussgrößen (Aminosäuresequenz, Konzentration, Heizrate) ermittelt und Versuche zur Quervernetzung und den daraus folgenden Auswirkungen auf das Denaturierungsverhalten durchgeführt. Außerdem wurde der Gyrationsradius vor, während und nach der Denaturierung mittels Röntgenkleinwinkelstreuung bestimmt.
Anschließend wurden Simulationswerkzeuge zur Untersuchung des Denaturierungsverhaltens auf atomarer Ebene erarbeitet. Hierzu wurden Kraftfeld, Modellerstellung, Simulationsmethodik und parameter sowie Analysewerkzeuge für das System CLP-Wasser optimiert und anschließend soweit möglich gegen experimentelle Daten oder Ergebnisse anderer Modellberechnungen überprüft.
Abb.1.: Hierarchischer Kollagenaufbau von der makroskopischen bis zur atomaren Ebene (Quelle: Wikimedia „Tendon anatomy“ und BERILLIS (2015): „Marine Collagen: Extraction and Applications“, SM Group)
Abb.2.: Denaturierungsprozesses für ein kurzes Kollagenpeptid in Form von Momentaufnahmen der Konformationen vor, während und nach der Denaturierung. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind die 3 Peptidketten der Tripelhelix schematisch in unterschiedlichen Farben dargestellt.
Ergebnisse
Die entwickelten Simulationswerkzeuge erlauben:
• Die Bestimmung der Denaturierungstemperatur von quervernetzten oder unvernetzten CLPs in gut realisierbaren Rechenzeiten auf ca. 5 K genau mit Hilfe von Simulationen unter kontinuierlicher Temperaturerhöhung. Dabei können im Gegensatz zu Methoden vom Stand der Technik verschiedene Einflüsse (wie Lösungsmittel, Wassergehalt, Anwesenheit von Fremdstoffen, Quervernetzungen usw.) berücksichtigt und deren Einflüsse analysiert werden.
• Die Bestimmung der bei der Denaturierung unter verschiedenen Bedingungen wirkenden Schrumpfkräfte.
• Die Analyse energetischer und struktureller Veränderungen der Moleküle sowie deren Wechselwirkung zur Umgebung während des Denaturierungsprozesses.
Mit diesem Hilfsmittel wurde die Möglichkeit geschaffen, neben grundlegendem Verständnis, einer Visualisierung der atomaren Prozesse sowie einer quantitativen strukturellen und thermodynamischen Prozessbetrachtung die Auswirkung verschiedener Prozessgrößen, Bedingungen und Ausgangsmaterialien auf die Produkteigenschaften auf rein theoretischem Wege abzuschätzen, ohne die Produkte vorher herstellen zu müssen. Die physikalische Natur der MD-Simulation erlaubt es weiterhin, die einmal entwickelten Simulationswerkzeuge auch auf davon abweichende Fragestellungen anzuwenden. Die MD-Simulationen werden deshalb als sehr nützliches Hilfsmittel bei der weiteren Wissens- und Verständnisgenerierung zur Denaturierung von Kollagenen angesehen. Das Simulationsverfahren soll damit zukünftig Vorhersagen ermöglichen, mit welchen Vernetzungsmethoden Kollagen thermisch besonders stabilisiert werden kann, ohne sämtliche mögliche Vernetzungsreagenzien experimentell testen zu müssen. Dies verbessert die Möglichkeiten der Produktentwicklung durch Senkung der Kosten und Steigerung der Qualität. Darüber hinaus werden systematische Untersuchungen des komplexen Denaturierungs¬verhaltens in einem Maßstab möglich, wie sie auf rein experimenteller Ebene derzeit nicht denkbar sind.
Dank
Das Forschungsvorhaben „Mechanismus der Kollagen-Denaturierung auf molekularer Ebene“, Reg.-Nr.: 49VF220029, wurde anteilig vom Bundesministerium für Wirtschaft und Energie (BMWE) aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages innerhalb des Förderprogramms „FuE-Förderung gemeinnütziger externer Industrieforschungseinrichtungen – Innovationskompetenz (INNO-KOM) – Modul - Vorlaufforschung (VF)“ über den Projektträger EuroNorm GmbH gefördert. Wir bedanken uns für die gewährte Unterstützung.
