Kollagenquantifizierung mittels Massenspektrometrie

BMWK INNO-KOM 49MF200008 | Laufzeit: 05.2020 – 10.2022 Birgit Voigt, Ina Prade, FILK Freiberg
  • Kategorien:
  • Biogene Rohstoffe
  • Kollagen
  • Prüfmethoden/Analyseverfahren

Ausgangssituation

Kollagen­basierte Biomaterialien werden häufig in der regenera­tiven Medizin zur Heilung von Gewebe­defekten einge­setzt (z. B. bei der Behand­lung von Wunden, zur Stillung von Blutungen, zur Rekon­struk­tion von Knochen- und Knorpel­schäden). Die Zusammen­setzung der Materialien aus den verschie­denen Kollagen­typen beeinflusst den Heilungs­erfolg und ist ein wich­tiges Kriterium für die Markt­zulassung eines kollagen­basierten Medizin­produktes.

Projektziel

Im Projekt sollten spezifische Massen­spektro­metrie-Assays (MRM-Assays) entwickelt werden, die eine Bestimmung der relativen Anteile von Kollagen der Typen I, II und III in Biomaterialien ermöglichen. Die Assays sollten für fünf häufig zur Kollagen­gewinnung verwendete Spezies (H. sapiens, B. taurus, S. scrofa, E. caballus, O. aries) nutzbar sein.

Lösungsweg

Die Kollagene wurden durch enzymatischen Verdau aus dem Material heraus­gelöst und die dabei entste­henden Peptide aufge­reinigt. In den MRM-Assays sollten anschließend drei Peptid-Ionen mit jeweils drei Fragment-Ionen pro Kollagen­typ und Spezies gemessen werden. Ein Peptid wird für die Quanti­fi­zierung genutzt, die anderen beiden dienen der sicheren Identi­fi­zierung. Die Auswahl der Peptide erfolgte nach bestimmten Kriterien: sie müssen stabil modifi­ziert und proteo­typisch sein, d. h. sie dürfen nicht in anderen Proteinen vorkommen. Um ein optimales Signal für jedes Peptid zu erhalten, mussten peptid­spezi­fische Geräte­para­meter des Massen­spektro­meters opti­miert werden (z. B. die Kollisions­energie zur Peptid-Ionen­fragmen­tierung). Zur Quanti­fi­zierung wurden die Flächen unter den Peptid­peaks im Ionen­chromato­gramm inte­griert. Mit speziell für das Projekt syntheti­sierten Standard­peptiden wurden auf die gleiche Weise Kalibrier­kurven erstellt und zur Berech­nung der Peptid­mengen genutzt. Anhand der ermittelten Peptid­mengen wurde auf die Kollagen­typen-Zusammen­setzung der Produkte geschlossen.

Ergebnisse | Nutzen

Zunächst wurden zahlreiche MS/MS-Messungen kollagen­basierter Proben durch­ge­führt und anschließend Peptide, die konstant detek­tiert werden konnten, für die MRM-Assays ausge­wählt. Insgesamt wurden 20 MRM-Assays entwickelt (getrennt nach Kollagen­typ und Spezies). Nach Opti­mierung der Mess- und Geräte­para­meter wurden diese zu einem Assay pro Spezies zusammen­gefasst. Im Ergebnis des Projektes liegen damit fünf MRM-Assays vor, mit denen die Kollagen­typen I, II und III in Materialien aus den oben erwähnten Spezies gemessen werden können.

Um die Anwend­bar­keit der Assays auf Material­proben zu prüfen, wurde die relative Kollagen­typen-Zusammen­setzung von Materialien bestimmt. Die rechte Abbildung zeigt beispiel­haft die Ergebnisse für verschiedene Proben von B. taurus, darunter kommerziell verfüg­bare Kollagen­standards, eigene Kollagen­präpara­tionen aus Kalbs­haut und am Markt befindliche Biomate­rialien. Ent­gegen den Hersteller­angaben bestehen alle drei Standards haupt­sächlich aus Kollagen­typ I. Daneben wurde in allen Standards auch Typ III gefunden. Kollagen­typ II wurde nur im Typ II-Standard gefunden. Die unter­suchten Biomate­rialien bestehen ebenfalls aus den Kollagen­typen I und III. Der prozen­tuale Anteil von Typ III ist aber unter­schied­lich. Um zu prüfen, ob die gemessenen Kollagentypen-Anteile korrekt sind, wurde das Verhältnis der alpha-Ketten des Kollagentyp I bestimmt. Das ist bekannt und sollte in etwa 2 (α1) : 1 (α2) betragen. Dies konnte für die Proben gezeigt werden.

Dank

Das Forschungs­vorhaben „Kollagen­quanti­fi­zierung mittels Massen­spektro­metrie“, Reg.-Nr.: 49MF200008 wurde anteilig vom Bundes­ministerium für Wirtschaft und Klima­schutz (BMWK) aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundes­tages inner­halb des Förder­programms „FuE-Förderung gemein­nütziger externer Industrie­forschungs­einrichtungen – Innovations­kompetenz (INNO-KOM) – Modul Markt­orien­tierte Forschung und Entwicklung (MF)“ über den Projekt­träger EuroNorm GmbH gefördert. Wir bedanken uns für die gewährte Unter­stützung.

Kontakt

FILK Freiberg Institute gGmbH
Meißner Ring 1-5
D-09599 Freiberg

Fon: +49-(0)3731-366-0
Fax: +49-(0)3731-366-130
E-Mail: mailbox@filkfreiberg.de