Kollagen-Polymer-Hybridmaterialien

BMWi INNO-KOM 49VF190015 | Laufzeit: 08.2019 – 01.2022 Maria Riedel, Enno Klüver, FILK Freiberg
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  • Biogene Rohstoffe
  • Kollagen

Ausgangssituation

In bio­medi­zinischen Anwendungen gewinnen kollagen­basierte Produkte aufgrund ihrer hervor­ragenden Bio­kompati­bilität und geringen Anti­genität zunehmend an Bedeutung. Diese Produkte sind vor allem für kurz­zeitige und mittel­fristige Anwendungen geeignet, da Kollagen im mensch­lichen Körper resor­bierbar ist und auch keine Abstoßungs­reak­tionen zu erwarten sind. Natives Kollagen ist insbesondere in feuchtem Milieu nicht mechanisch stabil. Es ist tierischen Ursprungs, was ethische, epidemio­logische oder reli­giöse Bedenken hervor­rufen kann. In dem Forschungs­vorhaben sollte ein Material entwickelt werden, welches die Vorteile eines reinen Kollagen­produkts (Bio­kompati­bilität, Resor­bier­barkeit, Zell­affinität) mit denen eines synthe­tischen, bio­kompa­tiblen Polymers vereint. Dafür sollten synthe­tische Kollagen­peptide (Collagen like peptides, CLP), die unab­hängig von natür­lichen Roh­stoff­quellen sind, mit einer polymeren Acrylat­matrix verbunden werden, die die notwendige mecha­nische Stabi­li­tät verbessert.

Projektziel

Es sollte ein bio­kompa­tibles Polymer synthe­ti­siert werden, das sich durch additive Fertigungs­verfahren verarbeiten lässt und an das Kollagen­peptide ange­bunden werden können. Die Kollagene sollten synthe­tisch herge­stellt werden. Die Amino­säure­sequenz sollte so gewählt werden, dass eine optimale Akzep­tanz der Zellen erreicht werden kann.

Lösungsweg

Ein wesent­licher Schwer­punkt lag auf der Synthese von acrylat- sowie acrylamid­basierten Copoly­meren. Die Polymere bestanden jeweils aus drei verschie­denen Monomer­einheiten, die verschiedene Funktionen erfüllten. Neben den grund­gerüst­bildenden Monomeren wurden Monomere mit Epoxy­einheit als Vernetzungs­punkt, mit Hydroxy­einheit zur Polaritäts­erhöhung und mit Anknüpfungs­punkten zur Peptid­kopplung einge­setzt.

Für die spätere Ankopplung von CLP an die Polymere wurden Cyclo­octine in das Polymer integriert. Die Azid­funktio­nalität der CLPs reagierte mit der Cyclo­octin­gruppe im Polymer in einer Klick­reaktion, der Azid-Alkin-Cyclo­addition.

Um die kovalente Ankopplung mittels Klick­chemie zu ermög­lichen, wurden von Kollagen abgeleitete Peptid­sequenzen definiert und durch kommer­zielle Anbieter herge­stellt. Die CLPs sollten die für die Kopplung notwendige Azid-Funktion und das für Kollagen typische Triplett Glycin-Prolin-Hydroxy­prolin enthalten. Das Triplett kann eine Tripel­helix ausbilden, welche insbe­sondere für die Zell­affini­tät Bedeutung hat.

Ein weiterer wesent­licher Schwer­punkt war die Klick­reaktion zwischen Polymer und CLP. Dafür erfolgte zunächst die Klick­reaktion eines Modell­moleküls mit dem Polymer. Als Modell­substanz kam ein azid­funktio­nali­siertes Poly­ethylen­glycol (PEG) zum Einsatz. Danach erfolgte die Klick­reaktion mit den synthe­ti­sierten CLPs.

Ergebnisse | Nutzen

Es wurden fünf Polymere unter­schied­licher Monomer­kombi­na­tionen synthe­ti­siert. Von diesen wurden jeweils mehrere Ansätze herge­stellt, wobei die ange­strebte theore­tische Mol­masse sowie das Einbau­verhältnis der Mono­mere zueinander vari­iert wurde. Mittels Gel­permeations­chromato­graphie (GPC) wurden Mol­massen (Mw) zwischen 9.400 g/mol und 281.600 g/mol und Dispersi­täten zwischen 1,3 und 2,0 ermittelt. Dispersi­täten über 1,5 deuten auf ein eher unkontrol­liertes Ketten­wachstum hin. Für die Struktur­unter­suchung der Polymere hinsicht­lich der Einbau­verhäl­tnisse der Mono­mere wurde die Kern­spin­resonanz­spektros­kopie verwendet. Trotz der Über­lagerung einiger Signale in den ¹H-NMR-Spektren konnten prinzi­piell die ange­strebten Einbau­verhält­nisse in synthe­ti­sierten Polymeren nachge­wiesen werden.

Die Einführung der für die Kopplung notwendigen Cyclo­octin­funktio­nalität sollte entweder über eine Amin­gruppe oder über einen Hydroxy­succinimid­ester erfolgen. Die Amin­gruppe war hierbei zunächst durch eine Boc-Schutz­gruppe geschützt, damit bei der Polymeri­sation keine uner­wünschten Neben­reaktionen auftreten konnten. Da die Abspaltung der Boc-Schutz­gruppe trotz zahl­reicher Variationen der Reaktions­bedingungen nicht zufrieden­stellend erfolgte, wurde die Octin­funktio­nalität in die Polymere über den Hydroxy­succinimid­ester integriert. Dieser Ester bringt zusätzlich den Vorteil, dass keine Schutz­gruppe notwendig war und der Schritt der Abspaltung entfiel.

Die Synthesen der CLPs, insbesondere jener mit den kollagen­typi­schen Tripletts, waren sehr anspruchs­voll. Verschie­denen Anbietern war es nicht möglich, die beauf­tragten Peptide in der gewünschten Rein­heit und Menge herzu­stellen. Die haupt­säch­lichen Schwierig­keiten bestanden in der unge­nü­genden Rein­heit, geringen Ausbeute, schlechten Löslich­keit und insta­bilen Azid­funktion. Aufbauend auf diesen Ergeb­nissen wurden abge­wandelte Amino­säure­sequenzen definiert, die durch den Einbau polarer Amino­säuren, wie Lysin, eine verbes­serte Löslich­keit aufweisen sollten. Zudem wurden Peptide gewählt, die an zentraler Stelle Sequenz­abschnitte enthalten, die aus der Literatur als Erkennungs­sequenzen für zelluläre Rezep­toren bekannt sind. Sie sind somit einer­seits kollagen­relevant. Anderer­seits brechen sie die einförmige Abfolge der Gly-Pro-Hyp-Tripletts auf, was sich auf die Synthese vorteil­haft auswirken sollte. Am Ende waren drei verschiedene Peptide reali­sierbar. Es wurden zwei CLPs mit (teil­weise im Vergleich zu Literatur­angaben abge­wandelten) Erkennungs­sequenzen sowie ein Peptid mit einer Zufalls­sequenz ohne Kollagen­bezug als Referenz­material herge­stellt.

Die Klickreaktion zwischen Polymer und CLP erfolgte mit einem ausge­wählten Polymer (P5-d), welches aus den Monomeren N-Isopropylacrylamid (NIPAm), Glycidyl­meth­acrylat (GMA) und Methacryl­säure-N-hydroxy­succinimid­ester (MAA-NHSE) aufge­baut war. Die Kopplung erfolgt zwischen P5-d und jeweils allen drei erhaltenen CLPs: GPD1, RGD1 und REF1 (Abbildung 1). Die Ausbeuten der erhaltenen Polymer-Kollagen-Hybrid­materialien waren sehr gering und wurden ausschließ­lich für IR-Spektros­kopie und DSC-Messungen eingesetzt.

In den DSC-Kurven des Kollagen-Polymer-Hybrids P5-d-GPD1 (Abbildung 2, schwarze Kurve) ist ein schwach ausge­bildeter Peak erkennbar. Das deutet darauf hin, dass die Peptide im Hybrid­material keine stark ausge­bil­dete Tripel­helix ausbilden können. Es ist zu vermuten, dass es zu einer Klick­reaktion gekommen war. Diese war nicht voll­ständig oder mit ausrei­chender Ausbeute, so dass sich nicht genug Peptide an dem Polymer befinden, um eine Tripel­helix auszu­bilden. Die IR-Spektren der Kollagen-Polymer-Hybride indi­zieren, dass bei mindes­tens zwei von drei CLPs die Klick­reaktion erfolg­reich verlaufen war.

Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass die Klick­reaktion zwischen Polymer und CLP prinzi­piell möglich war und auch, dass die Reaktion abhängig von der Struktur des CLPs zu sein scheint.

   

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Danksagung

Das Forschungs­vorhaben „Kollagen-Polymer-Hybrid­materialien“, Reg.-Nr.: 49VF190015 wurde anteilig vom Bundes­minis­terium für Wirt­schaft und Klima­schutz (BMWK) auf­grund eines Beschlusses des Deutschen Bundes­tages inner­halb des Förder­programms „FuE-Förderung gemein­nütziger externer Industrie­forschungs­einrichtungen – Innovations­kompetenz (INNO-KOM) – Modul Vorlauf­forschung (VF)“ über den Projekt­träger EuroNorm GmbH gefördert. Wir bedanken uns für die gewährte Unter­stützung.

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