Verfahren zur Herstellung von DNA-Markierungsmolekülen

BMWi INNO-KOM 49MF170074 | Laufzeit: 01.2018 – 06.2020 Birgit Voigt, FILK Freiberg
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  • Biogene Rohstoffe
  • Verfahren/Prozesse

Ausgangssituation

Die Fälschung von Produkten ist ein großes Problem im globalen Handel. Um Fälschungen zu erkennen und nachzuweisen, werden Verfahren gebraucht, mit denen Gegenstände und Materialien sicher markiert werden können. Markierungs­systeme können u. a. auf der Basis von DNA entwickelt werden. Damit sind auch flächige Materialien wie Leder, Kunstleder und Textilien markierbar. Zur Entwicklung und Anwendung solcher Systeme werden große Mengen DNA gebraucht. Es besteht daher Bedarf, DNA in großem Maßstab preiswert herzu­stellen.

Projektziel

Die biotechnologische Herstellung von DNA (in Form von Plasmiden) mit Hilfe von gentechnisch veränderten Mikro­organismen ist gut etabliert und relativ kosten­günstig. Bisher wird die hergestellte DNA für medizinische Zwecke verwendet. Aus Sicherheits­gründen können die verwendeten Stämme nicht für die Produktion von DNA zur Markierung von Material eingesetzt werden. Im Projekt sollten deshalb ein neuer bakterieller Produktions­stamm, Produktions­plasmide und ein Verfahren für die Herstellung großer Mengen spezifischer DNA-Markierungs­moleküle entwickelt werden.

Lösungsweg

Für das Markierungs­system wurden 20 DNA-Moleküle mit einer Länge zwischen 30 und 220 Basen­paaren bereit­gestellt, die in frei kombinier­baren Mischungen genutzt werden können. Zur Herstellung sollten die DNA-Markierungs­moleküle einzeln in ein Plasmid mit hoher Kopie­zahl kloniert und anschließend in den zu entwickelnden bakteriellen Produktions­stamm eingebracht werden. Da Plasmide in bakteriellen Zellen nur stabil erhalten bleiben, wenn die Zellen einem Selektions­druck ausge­setzt sind, sollte ein Plasmid-Addiction-System entwickelt werden. Dazu wird zunächst auf dem Plasmid eine Kopie eines essentiellen Genes platziert. Wird dieses Gen anschließend aus der chromosomalen DNA des Bakteriums deletiert, kann der Stamm nur wachsen, solange das Plasmid vorhanden ist. Damit sollten Produktions­stämme entstehen, die ohne Antibiotika als Selektions­mittel kultiviert werden können und mit denen große Mengen der DNA-Markierungs­moleküle herge­stellt werden können.

Ergebnisse

Es wurden 20 DNA-Markierungs­moleküle ausgewählt und die Nachweis­barkeit mit den designten Primern bestätigt. Die Moleküle konnten über das PCR-Verfahren, nicht aber über die Integration in ein Plasmid vermehrt werden. Damit lassen sich klein­technische Versuche, nicht aber die groß­volumige Markierung von Produkten realisieren. Zur Entwicklung eines Verfahrens wurde das Wachstum plasmid­tragender E. coli-Stämme und ihre Plasmid­produktion unter verschiedenen Bedingungen analysiert. Es wurde u. a. der Einfluss des Mediums, der Kohlen­stoff­quelle und des Temperatur­regimes untersucht. Die erzielten Plasmid­ausbeuten entsprachen den Mengen, wie sie für Schüttel­kolben­versuche durch­schnitt­lich erreicht werden. In diesen Versuchen enthielten die Plasmide nicht die gewünschte DNA. Die Versuche können jedoch als Basis für die Entwicklung von Fermentations­prozessen genutzt werden. Da es im Lauf des Projektes trotz zahl­reicher Versuche mit unter­schied­lichen Methoden nicht gelang, die Plasmide mit Ziel-DNA zu konstruieren, konnte der letzte Schritt, die Deletion eines essen­tiellen Gens und die Stamm­konstruktion, nicht durch­geführt werden. Die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung großer Mengen DNA-Markierungs­moleküle blieb deshalb unvoll­ständig.

Danksagung

Das Forschungs­vorhaben „Verfahren zur Herstellung von DNA-Markierungs­molekülen“, Reg.-Nr.: 49MF170074 wurde anteilig vom Bundes­ministerium für Wirtschaft und Energie (BMWi) aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundes­tages innerhalb des Förder­programms „FuE-Förderung gemein­nütziger externer Industrie­forschungs­einrichtungen – Innovations­kompetenz (INNO-KOM) – Modul Markt­orientierte Forschung und Entwicklung (MF)“ über den Projekt­träger EuroNorm GmbH gefördert. Wir bedanken uns für die gewährte Unter­stützung.

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